Chloroquine and mefloquine resistance profiles are not related to the circumsporozoite protein (CSP) VK210 subtypes in field isolates of Plasmodium vivax from Manaus, Brazilian Amazon

BACKGROUND The central repetitive region (CRR) of the Plasmodium vivax circumsporozoite surface protein (CSP) is composed of a repetitive sequence that is characterised by three variants: VK210, VK247 and P. vivax-like. The most important challenge in the treatment of P. vivax infection is the possibility of differential response based on the parasite genotype. OBJECTIVES To characterise the CSP variants in P. vivax isolates from individuals residing in a malaria-endemic region in Brazil and to profile these variants based on sensitivity to chloroquine and mefloquine. METHODS The CSP variants were determined by sequencing and the sensitivity of the P. vivax isolates to chloroquine and mefloquine was determined by Deli-test. FINDINGS Although five different allele sizes were amplified, the sequencing results showed that all of the isolates belonged to the VK210 variant. However, we observed substantial genetic diversity in the CRR, resulting in the identification of 10 different VK210 subtypes. The frequency of isolates that were resistant to chloroquine and mefloquine was 11.8 and 23.8%, respectively. However, we did not observe any difference in the frequency of the resistant isolates belonging to the VK210 subtypes. MAIN CONCLUSION The VK210 variant is the most frequently observed in the studied region and there is significant genetic variability in the CRR of the P. vivax CSP. Moreover, the antimalarial drug sensitivity profiles of the isolates does not seem to be related to the VK210 subtypes.

Apoptosis of non-parasitised red blood cells in Plasmodium yoelii malaria

Recently, while studying erythrocytic apoptosis during Plasmodium yoelii infection, we observed an increase in the levels of non-parasitised red blood cell (nRBC) apoptosis, which could be related to malarial anaemia. Therefore, in the present study, we attempted to investigate whether nRBC apoptosis is associated with the peripheral RBC count, parasite load or immune response. To this end, BALB/c mice were infected with P. yoelii 17XL and nRBC apoptosis, number of peripheral RBCs, parasitaemia and plasmatic levels of cytokines, nitric oxide and anti-RBC antibodies were evaluated at the early and late stages of anaemia. The apoptosis of nRBCs increased at the late stage and was associated with parasitaemia, but not with the intensity of the immune response. The increased percentage of nRBC apoptosis that was observed when anaemia was accentuated was not related to a reduction in peripheral RBCs. We conclude that nRBC apoptosis in P. yoelii malaria appears to be induced in response to a high parasite load. Further studies on malaria models in which acute anaemia develops during low parasitaemia are needed to identify the potential pathogenic role of nRBC apoptosis.

Apoptose em eritrócitos: envolvimento na patogênese da anemia da malária / Apoptosis in erythrocytes: involvement in the pathogenesis of malarial anemia

A anemia grave é sem dúvida uma das complicações mais comuns durante a infecção malárica e é uma das principais responsáveis pela elevada taxa de mortalidade de crianças e mulheres grávidas em regiões hiperendêmicas africanas. Embora os mecanismos que desencadeiam a anemia grave da malária ainda não tenham sido completamente elucidados, sabe-se que o aumento da destruição dos eritrócitos não parasitados tem importante contribuição na gênese dessa manifestação clínica. Frente a esse fato e tendo em vista a já descrita susceptibilidade dos eritrócitos ao processo de apoptose, que inclusive parece estar relacionado com a anemia de diversas patologias e pode ser induzida por diferentes tipos de drogas, decidimos estudar a apoptose eritrocitária e sua participação na anemia no decurso da infecção malárica. Primeiramente, avaliamos in vitro a capacidade da cloroquina, mefloquina, artemisinina e quinina em induzir apoptose em eritrócitos humanos. Nesta primeira investigação, observamos que os antimaláricos não tiveram efeito proapoptótico nestas células e, portanto, parecem não participar da anemia da malária através da indução de apoptose eritrocitária. Em seguida, estudando a infecção experimental de camundongos Balb/c pelo Plasmodium yoelii 17XL, constatamos um aumento nos níveis basais de apoptose de eritrócitos não parasitadas e sugerimos que este aumento poderia estar contribuindo com a anemia neste modelo experimental de malária. Porém, quando posteriormente examinamos em paralelo os níveis de apoptose e o grau de anemia, não foi possível observar relação entre estes dois eventos, mas sim entre a carga parasitária e os níveis de apoptose detectados na fase tardia da infecção. A possível influência da parasitemia nos níveis de apoptose eritrocitária parece ter encontrado suporte quando estudamos pacientes infectados pelo P. vivax. De fato, nessa infecção, que cursa com baixa parasitemia, não detectamos alteração nos níveis de apoptose eritrocitária. Como a apoptose além de ter propriedades patogênicas, também está envolvida com a limitação da propagação de parasitas intracelulares, avaliamos então in vitro a capacidade do P. falciparum de infectar eritrócitos apoptóticos. Neste último estudo, verificamos que estas células apoptóticas são refratárias à infecção plasmodial e, portanto, poderiam participar no controle da parasitemia na malária.

Antibodies against the Plasmodium falciparum glutamate-rich protein from naturally exposed individuals living in a Brazilian malaria-endemic area can inhibit in vitro parasite growth

The glutamate-rich protein (GLURP) is an exoantigen expressed in all stages of the Plasmodium falciparum life cycle in humans. Anti-GLURP antibodies can inhibit parasite growth in the presence of monocytes via antibody-dependent cellular inhibition (ADCI), and a major parasite-inhibitory region has been found in the N-terminal R0 region of the protein. Herein, we describe the antiplasmodial activity of anti-GLURP antibodies present in the sera from individuals naturally exposed to malaria in a Brazilian malaria-endemic area. The anti-R0 antibodies showed a potent inhibitory effect on the growth of P. falciparum in vitro, both in the presence (ADCI) and absence (GI) of monocytes. The inhibitory effect on parasite growth was comparable to the effect of IgGs purified from pooled sera from hyperimmune African individuals. Interestingly, in the ADCI test, higher levels of tumour necrosis factor alpha (TNF-α) were observed in the supernatant from cultures with higher parasitemias. Our data suggest that the antibody response induced by GLURP-R0 in naturally exposed individuals may have an important role in controlling parasitemia because these antibodies are able to inhibit the in vitro growth of P. falciparum with or without the cooperation from monocytes. Our results also indicate that TNF-α may not be relevant for the inhibitory effect on P. falciparum in vitro growth.

Investigação da susceptibilidade de formas sanguíneas do plasmodium falciparum à apoptose frente a estímulos com óxido nítrico, cloroquina e estaurosporina / Inquiry of the susceptibility of sanguineous forms of plasmodium falciparum to apoptosis front the stimulatons with nitric oxide, choloroquine and staurosporine

É fato conhecido que anticorpos, óxido ítrico e a cloroquina são capazes de inibir o crescimento in vitro do P.falciparum através de um mecanismo de morte ainda não elucidado. A susceptibilidade do P.falciparum à apoptose induzida pelo tratamento com parasiticidas foi investigada pela fragmentação de DNA por eletroforese e pelo ensaio de TUNEL. Assim, considerando que a apoptose poderia representar um mecanismo de manutenção da espécie, decidimos avaliar se a morte das formas eritrocíticas do P.falciparum é marcada ou não por eventos apoptóticos após diferentes tratamentos in vitro. Quando adicionamos ao cultivo de P.falciparum S-nitroso-acetil-penicillamina (SNAP-um doador de óxido nítrico), cloroquina ou estaurosporina, observamos tanto por microscopia óptica quanto por citometria de fluxo que esses compostos além de inibir o crescimento plasmodial, também foram capazes de reduzir os níveis parasitêmicos dos cultivos tratados por 24h, quando comparados com a parasitemia do cultivo inicial (0h). Já as IgGs de coelhos imunizados que foram capazes de reagir com antígenos do parasita não tiveram nenhum efeito no desenvolvimento plasmodial. Inesperadamente, quando analisamos pelo método de TUNEL a integridade do DNA nos parasitas mantidos em cultura sob os diferentes estímulos, apenas um baixo percentual de parasitas apresentou fragmentação de DNA. Além disso, o pré-tratamento do P.falciparum com um inibidor geral de caspases não foi capaz de prevenir a morte dos parasitas. A ausência desses eventos apoptóticos aliada à não identificação por análise ultra-estrutural de condensação de cromatina (outro processo associado a apoptose) e sim de um processo de vacuolização celular nos parasitas induzidos a morte, nos leva a concluir que as formas eritrocíticas do P.falciparum mantidas sob estresse farmacológico e imunológico não morrem por apoptose, mas por um processo de vacuolização similar a autofagia. Esse processo de vacuolização foi evidenciado mesmo no caso da ...